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申请号CN201410010871.1
名称柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用
申请人中国林业科学研究院热带林业研究所点击进入库内相关信息浏览
第一申请人中国林业科学研究院热带林业研究所
申请人国家CN
申请人省广东
申请人地址510520 广东省广州市天河区龙洞广汕一路682号
申请日2014-1-9
专利号CN201410010871.1
专利类型发明
年份2014
公开日2014-4-16
公开号CN103725785A
主分类号C12Q1/68
分类号C12Q1/68(2006.01)I
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第一发明人黄桂华
代理机构广州市华学知识产权代理有限公司 44245
代理人裘晖
摘要本发明公开一种柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用。柚木无性系指纹图谱的构建方法,包括如下步骤:柚木无性系基因组DNA提取,基因组DNA的SSR扩增,PCR扩增产物上测序仪分型,获得柚木无性系指纹图谱;本发明通过试验研究,优化了柚木SSR分子标记PCR扩增体系和程序,设计和筛选出柚木SSR多态性引物。本发明用筛选出来的15对具有多态性的柚木SSR引物,构建了26个柚木无性系的DNA指纹图谱。该方法经济、精确、快速和高效,为今后快速进行无性系指纹图谱构建和鉴定、柚木种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种提供了技术支撑。
权利要求一种柚木无性系指纹图谱的构建方法,其特征在于包括如下步骤:(1)柚木无性系基因组DNA提取以柚木无性系的叶片为材料,提取柚木无性系的基因组DNA,得到基因组DNA样品;(2)柚木无性系基因组DNA的SSR扩增以步骤(1)中得到的基因组DNA样品为模板,用柚木SSR多态性引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;(3)柚木无性系PCR扩增产物上测序仪分型取步骤(2)中获得的PCR扩增产物,加入超纯甲酰胺和LIZ?500分子量内标,得到上样液;将上样液变性,降温,然后进行柚木无性系SSR分型;(4)获得的柚木无性系指纹图谱用GeneMapper4.0软件进行谱带分析,读取每对引物扩增出的SSR片段的大小,得到柚木SSR多态性引物构建出的柚木无性系指纹图谱;步骤(2)中所述的柚木SSR多态性引物包括15对柚木SSR多态性引物,分别是AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764,其核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?No.1~30所示;步骤(2)中所述的PCR扩增的反应体系为:含浓度为25mM?Mg2+的10×buffer1.5μL,浓度为10mM的dNTPs?0.03μL,酶活为5U/μL的Taq?DNA酶0.3μL,浓度为10ng/μL的DNA?1.5μL,浓度为5μM的正向引物0.15μL,浓度为5μM的反向引物0.15μL,浓度为1nmol/μL的荧光?dUTP?0.015μL,加ddH2O至15μL;步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为:采用Touch?Down?PCR扩增程序:94℃预变性4min;94℃变性30s、Tm+10℃至Tm退火30s、72℃延伸1min,20个循环,每个循环退火温度降低0.5℃;94℃变性30s、Tm退火30s、72℃延伸1min,26个循环;72℃延伸10min;4℃forever;所述的Tm为51、53或56℃。
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